Pichia pastoris M1G1 geninin moleküler ve fonksiyonel karakterizasyonu

Abstract

Pichia pastoris rekombinant protein üretiminde konukçu organizma olarak yaygın ve başarılı bir şekilde kullanılan metilotrofik bir mayadır. Pichia sisteminin artan popülerliğini sağlayan sebepler arasında, bir çok ökaryotik transkripsiyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirebilmesi ve heterolog proteinleri hem hücre içi hem hücre dışı olarak çok yüksek miktarlarda üretebilme kapasitesine sahip olması sayılabilir. P. pastoris ekspresyon sisteminde, diğer sistemlerle karşılaştırıldığında çok yüksek verimliliklerde protein ekspresyonu gerçekleştiriliyor olmakla birlikte, sistemin verimliliğini arttırmak için çalışmalar yapılmaya devam edilmektedir.P. pastoris ekspresyon sisteminde protein üretimi genellikle metanol metabolizmasındaki ilk enzimi kodlayan alkol oksidaz geninin (AOX1) promotoru kontrolünde gerçekleştirilir. Çok sıkı denetim altında tutulabilen AOX1 promotoru, metanol tarafından tetiklenmekte (metanol indüksiyon), glukoz ve etanol tarafından baskılanmaktadır (katabolit represyon). AOX1 promotorunun indüksiyon ve katabolit represyon mekanizmaları ile kontrol edildiği bilinmesine rağmen bu mekanizmada rol alan regülasyon proteinleri henüz bilinmemektedir. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda yalnızca bir transkripsiyonal regülator proteinin (Mxr1 proteini) metanol indüksiyonunda aktivatör olarak rol aldığı belirlenmiştir.Bu çalışma kapsamında, P. pastoris'in katabolit represyon mekanizması çalışılmıştır. Bu amaçla, S. cerevisiae ve diğer mayalarda katabolit represyon mekanizmasında kilit rol oynadığı ve represör olarak DNA'ya bağlandığı tespit edilen Mig1 proteinini kodlayan MIG1 geninin, P. pastoris'te moleküler ve fonksiyonel karakterizasyonu yapılmıştır. MIG1 ve homoloğu MIG2 genlerinin inaktive edilmesi ile elde edilen tekli ( ? mig1, ? mig2) ve çift mutant ( ? mig1 ? mig2) suşlarının represyon (glukoz), derepresyon (gliserol) ve indüksiyon (metanol) koşullarında geliştirilmesi, gelişim eğrilerinin çıkarılması ve alkol oksidaz enzimi aktivitelerinin karşılaştırılması şeklinde gerçekleştirilen fonksiyonel analiz sonucunda MIG1 ve MIG2 genlerinin AOX1 geninin katabolit represyon mekanizmasında rollerinin olduğu ortaya çıkarılmıştır. MIG1 ve MIG2 genlerinin inaktivasyonu, hücrelerin gliserol ve glukozda gelişimlerinde herhangi bir fenotipik etkiye neden olmazken metanoldeki gelişimlerinde ? mig1 ve ? mig1 ? mig2 suşlarının gelişim hızlarında ve ulaştıkları hücre yoğunluğunda az da olsa bir artış gözlenmiştir. AOX enzim aktivitesi sonuçlarında ise glukoz/metanol besiyerinde hiçbir suşta aktivite tespit edilmezken, gliserol/metanol besiyerinde ? mig2 ve ? mig1 ? mig2 suşlarında sırasıyla ? %30 ve ? %50 oranlarında aktivite hesaplanmıştır. Elde edilen bu sonuçlarla PpMig1 ve PpMig2 proteinlerinin AOX1 promotorunun negatif regülasyon mekanizmasında yer aldıkları ilk kez ortaya konmuştur.