Pichia pastoris Etanol metabolizması üzerine çalışmalar

Abstract

Pichia pastoris, biyoteknoloji, ilaç endüstrisi ve akademik araştırmacılar tarafından rekombinant protein üretimi kullanılan bir ekspresyon sistemidir. P. pastoris, bakteriler gibi, tek karbon kaynağı olarak metanol, glukoz, gliserol veya etanol içeren ucuz besiyerlerinde hızla gelişme gösterebilmektedir. Ayrıca, insanlar gibi, ökaryotik bir organizmadır ve böylece hücre içi ortamı ökaryotik proteinlerin katlanması bakterilere göre daha uygundur. Buna ilaveten proteolitik işlemler, disülfit köprüsü oluşumu ve glukozilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonları gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Son zamanlarda, iki akademik araştırma laboratuvarı tarafından, iki farklı P. pastoris suşunun genom sekansı belirlenmiştir. P. pastoris GS115 genom sekansında ADH3 geni ile yapılan homoloji analizi, etanol metabolizmasında rol oynayan altı muhtemel ADH genini ortaya koymuştur. Literatürde bu genlerin hiçbiri üzerine moleküler düzeyde çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada, P. pastoris etanol metabolizmasında rol oynadığı düşünülen ADH3 geni inaktif edilerek, glukoz ve etanol içeren minimal besiyerinde üreme davranışları izlenmiştir. ADH3 mutant suşunun etanol içeren besiyerinde üremediği ancak glukoz içeren besiyerinde hala etanol ürettiği tespit edilmiştir. Sonuçlar, ADH3 geninin etanolün tüketiminden sorumlu tek gen olduğunu göstermiştir. Çalışmalara etanol üretiminden sorumlu olması muhtemel beş gen ile devam edilmiştir. Glukoz ve etanolde geliştirilen yabani suş ve adh3 suşunda bu muhtemel genlerin qRT-PCR metodu ile gen ekspresyon seviyesine bakılmış ve öne çıkan üç gen ile çalışmalara devam edilmiştir (adhI, adhII ve adhV). Bu genlerin zeosin antibiyotik dayanıklılık geni kullanılarak adh3 suşunda ikili mutantları elde edilmiştir. Elde edilen suşlar glukoz içeren minimal besiyerinde geliştirilerek etanol üretme yetenekleri test edilmiş ve etanol üretiminden sorumlu olan gen adhII olarak tespit edilmiştir. Tespit edilen gen ADH2 olarak isimlendirilmiştir. ADH2 geni karakterizasyonu için yapılan analizler sonucu, ADH2 geninin P. pastoris etanol metabolizmasında etanol üretiminden sorumlu majör gen olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, ADH2 geninin inaktif olduğu suşta etanol üretiminde ADH3 geninin de minör rol oynadığı tespit edilmiştir. Buna ilaveten, ADH3 ve ADH2 promotorları ile erlenmayer ve fementör ortamında rekombinant ksilanaz üretimi denemeleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar, ADH3 promotorunun fermentör ölçeğinde rekombinant protein üretimi için AOX1 ve GAP promotorlarına alternatif bir promotor olarak kullanılabilineceğini göstermiştir.