Tümör nekroz faktörü reseptör 1’in (TNFR1) sinyal iletim mekanizmasının araştırılması

Abstract

TNF-α, birçok farklı etki gösteren bir sitokin olup, etkilerinin çoğunu TNFR1 sayesinde sağlamaktadır. TNF-α aracılı NF-κB aktivasyonu, kaspaz aktivasyonu ve nekroptoz indüksüyonu üzerinde pek çok çalışma yapılmış olduğu halde TNFR1 aracılı ERK, Akt ve Stat3 aktivasyonları henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. TNFR1'in c-Src ve JAK2 gibi tirozin kinazlara bağlandığı bilinmekte fakat tirozin fosforilasyonu hakkında bir veri bulunmamaktadır. Tez çalışmamızda, TNFR1-JAK2 arasındaki ilişkinin TNFR1 tirozin fosforilasyonuna yol açıp açmadığını, eğer TNFR1 tirozin fosforilasyonuna uğruyorsa bunun TNF-α aracılı ERK, Akt, p38, JNK, Stat3 ve CREB aktivasyonlarını nasıl etkilediğini belirlemeyi amaçladık. Yöntem: TNFR1'in JAK2 ve PKA tarafından fosforile edildiği in vitro kinaz reaksiyonu ile gösterildikten sonra, potansiyel JAK2 ve PKA fosforilasyon motifleri site directed mutagenesis ile A ve D aminoasitlerine dönüştürüldü. Bu mutantların ERK, p38, JNK, Akt, Stat3, CREB, IRS-1 aktivasyon fosforilasyonlarına etkileri western blot ile; Grb2, p85, Stat3 bağlanmasına olan etkileri co-immunopresipitasyonla; NF-κB aktivasyonuna etkileri NF-Luc lusiferaz reporter sistemi ile, apoptotik sürece etkisi kolorimetrik kaspaz aktivasyon ölçümü ile, hücre sağkalımına etkisi MTT ve TNFR1 salınımına etkisi ELISA ile belirlendi. Bulgular: TNFR1, JAK2 ve PKA tarafından fosforile edilmekte, PKA fosforilasyonu JAK2 aracılı tirozin fosforilasyonunu baskılamaktadır. TNFR1'in Y401'den tirozin fosforilasyonu TNFR1 sinyalzomunda Grb2, p85 ve Stat3 bağlantısını kuvvetlendirmekte; ERK ve Akt aktivasyon fosforilasyonlarını arttırmakta, Stat3'ün ise DNA bağlanmasını kuvvetlendirmektedir. TNFR1'in Y360 noktasından fosforilasyonu, CREB ve Stat3 fosforilasyonunu arttırmakta, Y360A mutantı ise JNK ve p38 aktivasyonuna yol açmaktadır. Y401D mutantı ile transfekte hücrelerde, kaspaz aktivasyonu, NF-κB indüksüyon kapasitesi ve hücre sağkalımı düşük bulunmuştur. IRS-1 tirozin fosforilasyonu, TNFR1'in tirozin fosforilasyonundan da, PKA tarafından fosforilasyonundan da negatif etkilenmektedir. Sonuç: TNFR1, PKA ve JAK2 tarafından fosforile edilmekte; PKA fosforilasyonu tirozin fosforilasyonunu baskılayıcı etki göstermektedir. TNFR1 fosforilasyonları, TNF-α aracılı ERK, Akt, Stat3, p38, JNK, CREB aktivasyonları ve IRS-1 tirozin fosforilasyonunu farklı şekillerde düzenlemektedir.