Pichia pastoris mayasına sığır laktat dehidrogenaz geninin aktarımı ve laktik asit üretimi

Abstract

Laktik asit gıdadan kozmetiğe, tıptan kimya endüstrisine çok geniş bir alanda kullanım imkanına sahiptir. Laktik asidin, L (+)-laktik asit ve D (-)-laktik asit olmak üzere iki optik izomeri vardır. İzomerlerin saf olarak üretimi sadece fermentasyon yolu ile mümkündür. D (-)-laktik asit insan metabolizmasında asidoz ve kemik erimesine neden olabilmektedir. Ancak L (+)-laktik asit, biyolojik olarak tüketilebilmesi ve ilaç amaçlı kullanılabilmesi bakımından önemlidir. Pichia pastoris, biyoteknoloji ve ilaç endüstrisinde rekombinant protein üretimi için ihtiyaç duyulan bir ekspresyon sistemi olmasıyla birlikte araştırmacılar tarafından da sıklıkla kullanılmaktadır. P. pastoris, bakteriler gibi, tek karbon kaynağı olarak metanol, glukoz, gliserol veya etanol içeren ucuz besiyerlerinde hızla gelişim gösterebilmektedir. Bu tez çalışması kapsamında P. pastoris mayasında L (+)-laktik asit üretimi hedeflenmiştir. Bunun sebebi, bu mayanın şimdiye kadar laktik asit üretiminde kullanılan mikroorganizmalardan çok daha düşük pH'larda gelişme gösterebilmesidir. Ayrıca, L(+)-laktik asidin D(-)-laktik aside göre kullanımı daha yaygındır. Laktik asit üretimi için gen kaynağı olarak sığır (Bos taurus) genomuna ait L-laktat dehidrogenaz geni kullanılmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında P. pastoris ΔPDC (pirüvat dekarboksilaz) geni inaktif hale getirilmiştir. Pirüvatı L-laktik aside yükseltgeyecek olan L-laktat dehidrogenaz geni mayaya gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAP) ve pirüvat dekarboksilaz (PDC) promotorlarına bağlı olarak aktarılmıştır. Üretim ön çalışmaları çalkalamalı inkübatörde erlenler ölçeğinde yapılmıştır. Daha sonra, P. pastoris suşlarının L-laktik asit üretim kapasiteleri, kesikli fermentör koşullarında yapılan çalışmada en yüksek X33 pGAP-LDH ve FA115 pPDC-LDH tek kopya suşları tarafından yaklaşık 9,5 g/L (0,19 g/g) olarak gerçekleştirildiği belirlenmiştir. Kesikli beslemeli fermentör çalışmasında ise, L-laktik asit üretimini en yüksek FA115 pPDC-LDH iki kopya suşu 38,0 g/L (0,27 g/g) ile sağlamıştır. Bununla birlikte, ileride yapılabilecek; promotorların yeniden tasarımı, yeni promotorların kullanımı, gen kopya sayısının arttırılması, fermentasyon koşulları optimize edilmesi gibi modifikasyonlarla çok daha yüksek L-laktik asit üretim verimleri elde edilebileceği düşünülmektedir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, yapılacak olan benzer çalışmalara ışık tutacak niteliktedir.