Fare embriyonik kök hücrelerin endotelyal hücrelere farklanmasında Ctcfl geninin rolü

Abstract

Amaç: CTCFL, literatürde BORİS (Brother of the Regulator of Imprinted Sites), CCCTC-bağlanma faktörü-benzeri protein ya da CTCF-T olarak ifade edilen bir proteindir. Ctcfl'in aşırı ekspresyonunun embriyogenez sırasında, vasküler bozukluklar, çoklu organ patolojileri ve neonatal ölüm ile bağlantılı olduğu ortaya konulmuştur. Bu noktadan hareketle çalışmamızda, doksisiklin ile Ctcfl gen ekspresyonunun indüklendiği fare embriyonik kök hücrelerinde (EKH), Ctcfl'in aşırı ekspresyonunun in vitro endotel yönünde farklanmada etkisinin olup olmadığının araştırılması hedeflenmiştir. Yöntem: Çalışmamızda Ctcfl transgenik ve transgenik olmayan fare EKH'leri kullanıldı. Kültür medyumuna 2 μg/ml doksisiklin ilavesi ile Ctcfl gen indüksiyonu gerçekleştirildi. Kültür sonrasında ektopik gen ekspresyonunun sağlanıp sağlanmadığı qRT-PCR ile mRNA, Western Blot ile protein düzeyinde değerlendirildi. Ektopik Ctcfl ekspresyonunun yapıldığı transgenik deney grubu ile transgen içermeyen ve gen indüksiyonunun yapılmadığı kontrol grupları çalışmaya dahil edildi. Her grup kendi içerisinde endotel yönünde farklandırılan ve farklandırılmayan şeklinde iki gruba ayrıldı. Faz-kontrast mikroskopik değerlendirme ile endotelyal hücre farklanması gruplar arasında karşılaştırıldı. Flow sitometri yöntemi ile endotelyal farklanmanın erken dönem belirteçlerinden Flk1 ve VE-kaderin proteinleri analiz edildi. Ayrıca Flk1, VE-kaderin, CD31, CD34, VEGF, Flt1 protein ekspresyonları immünofluoresan boyanma ile değerlendirildi. Bulgular: Doksisiklin ile indüklenen grupta Ctcfl gen ve protein ekspresyonları, kontrol gruplarına kıyasla anlamlı bir şekilde yüksek bulundu. Deney grupları arasında Flk1, VE-kaderin, CD31, CD34, VEGF ve Flt1 proteinlerinin ekspresyon paternleri açısından farklılık izlenmedi. Flow sitometri sonuçlarında, Flk1 ve VE-kaderin proteinleri gruplar arasında benzer ortalama fluoresan yoğunluk değerleri gösterdi. Sonuç: Bulgularımızda ektopik Ctcfl ekspresyonunun, in vitro endotel farklanmada Flk1 ve VE-kaderin ekspresyonları açısından belirgin bir etkisinin olmadığı gözlendi. Farklı belirteçler ve deney modelleri ile konunun olası moleküler mekanizmalarının aydınlatılması gerektiği kanısındayız.