DNA metilasyonunun fare embriyolarının iç hücre kitlesinde pluripotensi üzerindeki etkisinin araştırılması

Abstract

Kök hücreler başka hücrelere farklanma ve gelişim potansiyeli en yüksek olan hücrelerdir. Embriyonik kök hücrelerin en önemli kaynakları implantasyon öncesi blastosistlerin iç hücre kitleleridir. Bu hücreler kendilerine özgü olan ve diğer hücrelerde olmayan transkripsiyon faktörleri sentezlerler. Bu faktörler, hücrelerin başka hücrelere farklanma ya da kendi kendilerini yenileme özelliklerinin başlıca yönlendiricileridir. Çalışmamızda epigenetik hücre düzenleyicilerinden biri olan DNA metilasyonuna, inhibitör ile müdahale edilerek embriyonik kök hücre belirteci Nanog'un ekspresyonuna etkisini ve böylece hücrelerin pluripotensilerine direkt etkilerini görmek amaçlanmıştır. Yöntem: Çalışmamızda Balb/c ırkı olgun dişi hamile farelerden embriyonik 3.5. günde uterus diseksiyonu ve boynuz yıkaması ile elde edilen embriyolara 50 mikrolitrelik damlacıklar içerisinde işlemler uygulanmıştır. Total blastosist gruplarına ve immünocerrahi işlemiyle elde edilen iç hücre kitlelerine metilasyon inhibitörü uygulanarak 5-Metilsitozin antikoruyla metilasyon seviyeleri ve Nanog antikoruyla pluripotensi seviyelerindeki değişimler değerlendirilmiştir. Sonuçlar ImageJ ile analiz edilmiştir. Bulgular: Total blastosist gruplarında 0,1 µM inhibitör uygulanan gruplarda hem 5-Metilsitozin hem de Nanog immünofloresan ekspresyonlarında anlamlı artışlar gözlenmiştir. 1 µM inhibitör uygulanan grupta ise 5-Metilsitozin ekspresyonundaki düşüş kontrol gruplarına göre anlamlı bulunmazken Nanog ekspresyonunda anlamlı azalma olmuştur. İmmünocerrahi gruplarında 0,1 µM inhibitör uygulanan gruplarda hem 5-Metilsitozin hem de Nanog ekspresyonları kontrol gruplarına göre azalmıştır. Sonuç: Bu çalışmada total blastosistte ve immünocerrahi ile elde edilen iç hücre kitlelerinde metilasyonun pluripotensiye etkisi incelenmiştir. 5-metilsitozin ve Nanog ekspresyon seviyelerindeki değişimler bu iki hücre grubunun inhibitöre olan cevaplarının farklı olduğunu göstermektedir. Nanog ekspresyonunun da hücre içi lokalizasyonunda değişiklikler olduğu görülmüştür. Çalışmamız pluripotent kök hücre kültürleriyle ilgili yapılacak olan çalışmalara katkı sağlayabilir.